层析柱装柱步骤流程

发布时间:2024-03-25


  1. 计算每厘米柱床高度填料的数量;

  2. 选择合适的配件和末端筛网,选择不合适的滤网可能导致较高反压或填料泄露;

  3. 选择装柱流速

  首先:拍排泡

  第二:调水平

  第三:匀浆

  第四:装柱

  第五: 绘制压力/流速曲线,装柱流速为流速的70%-100%。

  柱效检测

  柱效主要取决于装柱质量。如果是离子交换或亲和层析填料,则不能使用有色物质,如蓝色葡聚糖。表征柱效的两个好指标是理论板当量高度(HETP)和对称因子As,使用NaCl或丙酮通过测定UV吸收或电导率进行计算。

  使用NaCl溶液进行测定,优点样品是易得、安全,缺点是可能与填料发生反应,特别是离子交换树脂,因此影响测定结果。使用丙酮进行测定,其不与层析填料发生反应,并且可通过检测280 nm处的紫外吸收进行测定,并且,测定缓冲液的浓度可提高至10倍。

  1. HETP计算

  所用样品为1.0%NaCl或纯丙酮溶液,上样大约为总柱床体积的1%。对于34和50μm的填料,使用的线性流速应为30 cm/h,90μm的填料选择20 cm/h的线性流速。通过下式计算HETP:

  HETP = L/N

  其中L为柱床高度(cm),N为理论塔板数,N=5.54 (Ve/Wh)2;

  Ve为洗脱体积(mL),Wh峰高一半处的峰宽(mL)。

  2. 峰对称因子计算

  洗脱峰的峰形应尽可能对称,即对称因子尽可能接近1。As按下列公式计算:

  As = b/a

  其中,a为峰高10%处的前半个峰宽,b为峰高10%处后半个峰宽。